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兰花组织培养关键技术探讨

[作者:曹青爽  来源:新疆林业科学院  时间:2018-5-26  阅读:1724次][字体:字体颜色]
 

植物组织培养指在无菌条件下利用人工培养基对植物组织进行培养。近年来这项技术的应用范围十分广泛,尤其是我们通过对兰花(寒兰、春兰、大叶风兰、小叶风兰、紫香兰、墨兰等)采用植物组织培养方法快速繁殖优良苗木已在生产中广泛应用。如何降低成本是提高效率和经济效益的主要问题。兰花植物组织培养过程中造成失败的原因很多,尤其一些技术环节稍有疏忽便会延误实验进程甚至导致整个试验的失败,因而分析和研究组培工作中应该注意的技术问题是非常必要的。本文旨在通过总结几年来从事兰花组培工作的实践经验,对一些常见的问题进行提出相应的解决办法。

1.外植体材料的选择

用于兰花离体繁殖的外植体材料很多。通常选择有新芽、幼叶、茎尖等。茎尖是最早用于兰花快速繁殖的外植体。大花蕙兰(Cymbidium)、嘉德丽亚兰(Cattleya)、石 斛 兰  (Dendrobim)、 蝴 蝶 兰(Phalaeanopsis)、文心兰(Oncidium)等首先在茎尖培养中取得成功。侧芽的应用也很广泛,一般认为带12个叶原基的茎原椎成活率高,中间部位侧芽成活率及生长率较高。但因为有的兰花只生一茎摘取茎尖就有可能丧失母株,因此.我们采用叶片作外植体可以减轻或避免对母株的伤害,又不受季节的限制,数量又多,是比较理想的外植体材料。取材大多数以叶片为外植体的是取试管苗的幼叶为培养材料,从成熟植株上取幼叶为外植体培养成功的报道不多。有研究指出蝴蝶兰试管苗幼叶原球茎发生率可达90%,而成熟叶对诱导反应极弱 。这可能是由于成熟植物组织向培养基中释放高浓度的抑制生长物质,严重影响兰花组织的存活,但兰成熟植株最上面3片幼叶在培养中却显示出较强的增殖能力,在l0l2周内基部分化出芽,但不产生原球茎 ;从幼叶的叶尖表皮细胞和叶肉细胞直接培养出体细胞胚30d之内无愈伤组织产生,在经过下一级的培养后分化出幼苗。

2.培养基与植物激素选择

2.1培养基的选择

在兰花的组织培养中,根据兰花种类的不同,所需要的培养基种类比例等均不同。当通过一系列的实验,对这种培养基做了某些定性和定量的小变动之后,即有可能得到一种能满足植物生长需要的新培养基。最常用的培养基为MSVWKCHRMWhite和它们的改良型,应用时可根据不同品种和培养阶段——类原球茎的形成、增殖、分化及壮苗等加以修改。如春兰要求培养基中的无机盐量要少,惠兰要求的量较大,而墨兰则不敏感;用改良的MS培养基可加速紫香兰及黄瓣红心兰类原球茎的形成,12MS培养基则利于类原球茎的生根。在生根培养基中发现在液体培养基中添加活性炭、苹果汁、香蕉汁和椰子汁进行悬浮培养,使春兰、风兰及寒兰原球茎的生长和发育状态可达到最佳。

2.2植物激素

植物激素是诱导愈伤组织和绿苗分化的关键因素。兰花生长调节激素浓度对它的分化和增殖起到重要的作用,不同的兰花种类对其浓度要求是有差别的,在实验中要对其做进一步的改良,植物激素对细胞的生长、分化、发育等一系列的生理变化和形态建成起着控制作用,选用恰当的植物激素种类、用量及配比是组织培养技术中的关键环节。目前常使用的外源激素主要是生长素类 (IAAIBANAA24-D)和细胞分裂素类(KTZT6-BA)。对不同的兰花来说在不同的生长发育阶段所需激素的量和种类都不尽相同。KT的主要作用是促进细胞分裂和愈伤组织分化。6-BA对植物体细胞胚的发生与发育具有重要作用。Kusumoto报道24DKTGA+NAA有助于兰属杂交种原球茎的生长,24D+GA3有利于芽的生长,GA+NAA有利于根的形成。NAAKT能促进兰属原球茎的生长。 10mgLBA对墨兰与大花惠兰种间杂种原球茎的增殖效果最好;对紫香兰、春兰的组培中发现1.06BA+01H·LNAA有利于丛生芽的诱导;在对墨兰的研究中发现05mgINAA+ 10mgLBA有利于墨兰根状茎的增殖;培养基中添加2 mgLBA+02mgLNAA时,黄瓣红心兰原球茎既能增殖又能分化成苗率较高且根系健壮。各类植物激素的生理作用虽有相对专一性,但是植物的各种生理效应是不同种类激素之间相互作用的综合表现。

3.培养基的配制

3.1 配制大量元素母液时残留不溶物

要严格按照培养基配方中的各成分比例及排列次序进行配置培养基。配制大量元素母液时,或者直接配置培养基时出现沉淀物可能是某些无机离子如Ca SO42- HP042-等在一起发生化学反应,产生不溶物所以母液配制或直接配置培养基时最好用纯度高的重蒸馏水溶解,药品采用纯度较高的分析纯,最好先用少量温水将各种无机盐类分别溶解后再按配方中所列的顺序逐个倒入,边倒边搅拌另外,铁盐也易发生沉淀,需单独配置。

3.2维生素母液在冰箱中贮存易受真菌污染

维生素母液在冰箱中贮存时易受真菌污染配制母液时用无菌水溶解维生素,贮存在灭过菌的试剂瓶中。

4.灭菌

通常采用物理的或化学的灭菌方法。

4.1外植体灭菌

兰花采用盆栽外植体,手术刀切下茎部或采用叶片时,在自来水下冲洗20min左右,再将兰花用75%酒精杀菌后,转入不再用75%的酒精和0.1%升汞分别杀菌1min8min,然后用无菌水清洗干净,要根据苗子的老嫩程度,决定灭菌时间,这种灭菌效果成活率较高。

4.2培养基的灭菌 

培养基的污染以细菌污染为主,在培养基灭菌时,一定要将高压灭菌锅内的冷气排尽,使灭菌锅温度保持在121左右2530min。消毒锅的压力表降到零后不能马上出锅,因冷热空气作用产生的负压效应,使外界环境的冷空气倒吸入已灭菌的培养瓶内引起真菌污染,为避免该现象的发生,消毒后培养瓶应待锅内稍冷却后才出锅。灭菌后培养基应放置1周左右,用于检查培养基是否污染方可使用。

5.污染的防止

5.1无菌接种室及器具的污染 

每天接种前和接种后都要用消毒液对工作室进行清洁卫生工作,然后打开紫外灯灭菌2030min,无菌操作台的风机需打开30min左右。接种室要经常通风换气。2030d用高锰酸钾等对室内彻底消毒,避免细菌的大面积发生。对接种中所需的工具,必须经严格灭菌后才能使用。在超净工作台的操作区内,不要放入过多的待用材料,避免气流被挡住。

5.2人为污染的防止

接种前应将手洗净,再用70%酒精擦洗双手及超净工作台面,及接种用的器具或器

皿。接种器具要用1次消毒1次。接种时瓶子要倾斜,使瓶口位于火焰的前方,以利烘烧,防止细菌落入瓶中。接种人员的培训很关键,应严格执行无菌操作,穿工作服,戴工作帽。检查培养容器是否存在问题,培养容器封口多用塑料盖、胶塞、棉塞、薄膜等,塑料盖用久了易老化,密封性差,也会造成污染。培养瓶口越大,用薄膜封口污染率越高,而三角瓶用棉塞的污染率较低,且生长良好。

5.3扩繁培养中污染的防止

扩繁培养中操作技术人员一定要严格检查用于继代繁殖的试管苗,及时发现淘汰污染试管苗,避免造成交叉污染,所以组织培养中要进行培养材料的原种保存工作。还可在培养基中加入抗菌剂来防止污染。污染率与转接时间有关,培养4560d一定转接,这样可以减少污染率。

5.4减少培养基中的有机成分

通过多年的组织培养兰花试验工作得出,减少培养基中的有机成分可有效控制污染,使污染的试管面不受细菌的影响而能够生长。

6.褐变问题

兰花外植体呈褐色,逐渐坏死可能是因表面灭菌剂浓度过高、处理时间过长;植物生长调节物质用量过多;培养温度过高等因素造成的。可选用降低灭菌剂处理浓度或减少处理时间,适当降低激素浓度或降低培养温度等方法,以预防此现象发生。一般选择幼嫩的器官和组织做外植体,切取外植体时尽量减少伤口面积及选择适宜的消毒剂;适当降低培养基中无机盐浓度,降低PH值,降低细胞分裂素浓度等,可显著减轻培养物褐变;兰花选择适宜的温度及在初始培养的16周内用暗培养或在150lx左右的光强下进行光培养可抑制酚类物质氧化。另外,对培养物进行连续转移,在培养基中加入抗氧化剂或活性炭,都可有效抑制褐变。

以上所述的6个关键技术在植物组织培养中是非常重要的,只有在组培的各个环节严格、规范操作,才能尽量避免其问题的发生。在组培过程中不管采取哪种具体措施,都要保证控制褐变、污染及各个环节不出问题,这些都有待我们进一步去分析、研究和改进。
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